Micro-fotografie

Sinds de ontwikkeling van digitale camera's is micro-fotografie een stuk gemakkelijker geworden. Je kunt nu onbeperkt foto's nemen en het resultaat direct bekijken. Dat geeft veel meer mogelijkheden met betrekking tot het optimaliseren van de opnames. Een goede opname begint met een goede belichting en dat kan niet vaak genoeg gezegd worden. Dat er een eenvoudige compact camera of een dure systeemcamera wordt gebruikt is eigenlijk minder relevant. En het is eveneens niet noodzakelijk om de microscoop uit te rusten met objectieven die de hoogste correctie-graad bezitten zoals (plan)apochromaten. Een goede belichting is meer dan al het andere verantwoordelijk voor een goede microscoop-foto. Dit komt ook ter sprake in het artikel 'Wat je kunt zien met een eenvoudige microscoop'.

Micro-fotografie is heel iets anders dan macro-fotografie. Met micro-fotografie gaan we een flinke stap verder en om goede microscopische opnames te maken is kennis van microscopie noodzakelijk. De microscoop is het belangrijkste instrument, niet de camera. Bij micro-fotografie gaat het niet alleen om mooie foto's maken maar ook om de inhoud ervan en het vergaren van kennis en informatie. Een minder mooie foto hoeft daarom niet minder waardevol te zijn.  Hier worden enkele mogelijkheden beschreven om te fotograferen door een microscoop en wat daarvoor nodig is.

Smartphone en tablet

Heel veel camera's zijn tegenwoordig geschikt voor micro-fotografie. Laten we eens beginnen met de camera die bijna iedereen constant op zak heeft: de smartphone. De kwaliteit van smartphone camera' s is de laatste jaren sterk verbeterd zodat ze nauwelijks nog onderdoen voor een compact camera en er kunnen zeer aardige micro-foto's mee worden gemaakt. Zelfs met sommige tablets zijn redelijke microscoopfoto's te maken; hiervan zal ik later een paar voorbeelden laten zien. Smartphone en tablets hebben een kleine lens en dat is een voordeel met betrekking tot de keuze van het oculair waardoor men wil fotograferen. Met zo'n kleine lens kun je namelijk heel dicht bij de frontlens van een oculair komen. Veel Huygens oculairen hebben een lage uittree-pupil waardoor je met een DSLR camera bijna onmogelijk het ronde gezichtsveld scherp in beeld kunt krijgen. En zelfs met sommige compact camera's wordt het al lastig. Wil je met dat soort camera's fotograferen dan heb je bij voorkeur een groothoek oculair (wide field, WF) met hoge uittree-pupil nodig. Met een smartphone is met alle oculairen de rand van het ronde gezichtsveld scherp in beeld te krijgen.

De eenvoudigste manier om met een smartphone door een microscoop te fotograferen is door de lens van de smartphone zodanig boven het oculair te houden totdat je het microscopisch gezichtsveld als een scherp omrande cirkel ziet. Dit vergt in het begin wat oefening, vooral ook om de telefoon stabiel te houden. De truc is om de middelvinger van de linkerhand (het dichtst bij de lens) tegen de microscoop tubus aan te houden wat zorgt voor ondersteuning. Het is makkelijker om door een Huygens oculair te fotograferen omdat je daarbij dichter bij de frontlens komt. Bij groothoek oculairen moet je de smartphone al gauw een paar cm van de lens houden zodat je moeilijker met een hand kunt ondersteunen. Er zijn smartphone adapters te koop die je aan de microscoop-tubus kan bevestigen en waarin je de telefoon kunt klemmen. Op die manier is het mogelijk om alles live op het scherm van de telefoon te bekijken. Omdat een smartphone een kleine sensor heeft zal de foto geen heel grote resolutie hebben, tenminste, vergeleken met een systeem camera. De kwaliteit van het beeld kan nog verbeterd worden door een hoger vergrotend te oculair nemen, bijvoorbeeld een 15x i.p.v. het gebruikelijke 10x oculair. De gedachte hierachter is dat de sensor een kleiner deel van het beeld opneemt waardoor het hele sensor oppervlak wordt gebruikt voor het vastleggen van informatie van dit deel. Details worden dus beter vastgelegd. Je kunt foto's die op deze manier zijn genomen ook wat meer uitvergroten voordat ze "korrelig" worden. Het is goed om te realiseren dat er minder pixels nodig zijn naarmate de objectief-vergroting stijgt. Een beeld gemaakt met een 40/0.65 objectief bevat minder informatie dan dat van een 10/0.25 objectief. Met objectieven met hogere vergrotingen worden dus de beste resultaten bereikt. Ook met een tablet is het mogelijk aardige foto's te maken, al is dat wel wat onhandiger.

Hieronder volgen enkele beelden die ik heb gemaakt met een smartphone, de Samsung Galaxy A8 (SM-A530F, 16 MP), Samsung Galaxy A3 (SM-A300FU, 8 MP) en tablet (Huawei Mediapad T3, 5 MP).

Oogflagellaten met rode oogvlek (Euglena) en blauwalgen (Anabaena) gefotografeerd met de Samsung Galaxy A8. Optiek: Carl Zeiss Neofluar 40/0.75 met oculair Kpl12.5x W.

Cellen van waterpest (Elodea) met talrijke chloroplasten. Foto gemaakt met de Samsung Galaxy A3. Zeiss-Winkel achromaat 40/0.65 en Olympus P15x oculair.

Opname van filamenteuze algen (Spirogyra en Mougeotia) gemaakt met de Samsung Galaxy A3. Zeiss Neofluar 63/1.25 objectief met Zeiss Kpl12.5x oculair. Digitale zoom: 2x.

Histologische preparaten van mens (links) en plant (rechts) gefotografeerd met de Huawei tablet. Optiek: Zeiss-Winkel 100/1.3 (links) en Zeiss-Winkel 40/0.65 (rechts).

Compact camera

Met een compact camera kunnen prima microscoop foto's worden gemaakt. Het handigst zijn de camera's met interne zoom, dus waarbij de lens niet naar buiten beweegt. Deze camera's kunnen dichtbij of zelfs tegen het oculair gehouden worden. Zelf heb ik lange tijd een Olympus Stylus 725 SW gebruikt. In het begin zette ik deze camera op een statief voor het oculair en dat werkte prima. Met oculairen die een lage uittree-pupil hebben kan zo´n camera tegen het oculair gehouden worden wat tevens zorgt voor ondersteuning.

Systeemcamera

Wil je het microscopische beeld nog beter vastleggen dan is een systeemcamera een betere keuze. Zowel met micro 4/3 als met DSLR crop sensor camera's zijn uitstekende micro-foto's te maken. Een full-frame camera is voor micro-fotografie eigenlijk niet nodig, mits je films van hoge kwaliteit wilt gaan maken. Er is een belangrijk aspect bij de keuze van een systeemcamera voor micro-fotografie: trillingen. Camera's met een mechanisch sluitermechanisme kunnen trillingen veroorzaken waardoor de foto onscherp wordt. Meer nog dan bij normale fotografie hebben trillingen bij micro-fotografie een grote impact omdat je met zulke hoge vergrotingen werkt. Zelf werk ik met zowel een Olympus PEN E-PL1 als een Canon EOS 600D, beide wat oudere modellen die echter nog prima voldoen. De Olympus PEN veroorzaakt significante trillingen bij korte belichtingstijden, deze camera heeft geen electronische sluiter. Naarmate de belichtingstijd langer wordt (2 sec of meer) wordt de invloed van het sluitermechanisme aanmerkelijk minder. Als ik deze camera gebruik fotografeer ik uitsluitend statische objecten omdat ik een belichtingstijd van 2.5 seconden hanteer. De Canon 600D heeft een electronische sluiter en er ontstaan geen trillingen voordat de spiegel naar beneden klapt; de opname wordt in LiveView gemaakt. De spiegel wordt eerst opgeklapt (mirror lock-up), de foto wordt genomen en pas daarna klapt de spiegel naar beneden. Om handmatige trillingen te vermijden gebruik ik bij beide camera's een 2 seconden durende vertraging tussen het moment dat de knop ingedrukt wordt en de foto wordt genomen. Van Canon is er een aantal DSLR camera's uitermate geschikt voor micro-fotografie. Het gaat dan o.a. om de 500D, 550D, 600D, 650D, 700D en 750D.

Na de keuze voor een bepaalde camera volgt de koppeling van de camera met de microscoop. Micro-fotografie met een systeemcamera kan zowel met als zonder camera-objectief bedreven worden. De opzet zonder camera-objectief is wat eenvoudiger maar stelt wat hogere eisen aan het oculair dat gebruikt wordt om het beeld op de sensor te projecteren. Voor de Olympus PEN heb ik lange tijd een Sigma 30 mm objectief gebruikt en dat werkt prima. Deze lens heeft als voordeel dat er geen extern bewegende delen zijn als scherp gesteld wordt, alles gebeurt binnenin het objectief. Daardoor is het mogelijk om de lens ergens op te zetten. De volgende afbeelding laat een opzet met de Sigma lens zien die ik veel heb gebruikt met een hoefijzer-statief. Met een Ihagee klem-adapter en rubberen ring wordt een soort van plateau gecreëerd waar de camera opgezet kan worden. Door het gewicht van het objectief blijft de camera probleemloos staan. Het is een handige set-up voor een kantel-statief; nadat de foto gemaakt is wordt de camera van het plateau afgehaald en kan er verder gekeken worden. Een tweede voordeel van het Sigma objectief is de naar voren gelegen intree-pupil. Daardoor kan elk microscoop oculair gebruikt worden, ook de Huygens oculairen met lage uittree-pupil.

Olympus PEN E-PL1 met Sigma 30 mm objectief geplaatst op een Olympus hoefijzer-statief.

Het spreekt voor zich dat met een systeem-camera betere kwaliteit foto's gemaakt kunnen worden door de hogere resolutie maar dat wordt echter pas duidelijk wanneer men de foto gaat uitvergroten. De volgende afbeeldingen laten een vergelijking zien tussen de Olympus PEN en de Huawei tablet met een preparaat van Cymbella.

Vergelijking tussen de Olympus PEN (boven) en Huawei tablet (onder) met een preparaat van Cymbella. Optiek: Leitz achromaat 40/0.65 en Leitz Periplan GF 10x oculair.

Olympus PEN (links) versus Huawei tablet (rechts). Optiek: Leitz achromaat 40/0.65.

De Olympus PEN en Canon 600D gebruik ik tegenwoordig alleen nog maar zonder camera-lens. Hierbij wordt het beeld door het oculair op de sensor geprojecteerd. Hier komen met name de beter gecorrigeerde compenserende groothoek-oculairen voor in aanmerking. Voor de Leitz Dialux II gebruik ik hier een Periplan GF 10x oculair voor dat in de foto-tubus wordt geplaatst. De set-up met de Canon 600D is hieronder te zien. Ik heb gemerkt dat beelden die gemaakt zijn zonder tussenkomst van een camera-objectief wat contrastrijker zijn. Dat is ook vrij logisch, er zit minder glas in de optische stralengang.

Aanpassing van de Canon 600D aan de Leitz Dialux II zonder camera-lens. Een periplan GF 10x fungeert als projectie-oculair.

Om te testen of een camera-aanpassing deugdelijk is gebruik ik een object-micrometer en een 'echt' preparaat. Als de optische afstemming niet klopt dan zullen allerlei optische aberraties zichtbaar worden. Naast de object-micrometer gebruik ik vaak een preparaat met pollen omdat daarmee de chromatische aberratie vrij snel opvalt door blauw gekleurde randen rondom de pollenkorrels. In de volgende afbeeldingen is te zien dat met de Canon set-up de aberraties minimaal zijn.

Object-micrometer gefotografeerd met een Leitz NPL Fluotar 25/0.55. Met een Periplan GF 10x oculair wordt het beeld op de sensor van de Canon 600D projecteert. Alleen aan de randen is een klein beetje onscherpte zichtbaar. In een microscopisch preparaat dat enige diepte heeft is deze onscherpte aan de rand nauwelijks relevant.

Pollenkorrels van verschillende plantensoorten gefotografeerd met de Canon 600D en een Leitz NPL Fluotar 25/0.55. Een Leitz Periplan GF 10x is wederom als projectie-oculair gebruikt. Dit is de volledige afbeelding zoals die door de sensor van de Canon wordt opgenomen.

Ook een vers planten-preparaat kan prima dienst doen om optische afwijkingen op te speuren. De epidermis van Dracaena marginata leent zich goed voor zulke testen, chromatische aberratie zal snel zichtbaar worden rondom de fijne ruitvormige kristallen en de transparante cellen.

Epidermis van Dracaena marginata gefotografeerd met de Canon 600D en een Leitz Fluotar 25/0.55. Over de gehele lengte is de kwaliteit van het beeld goed. Onscherpe gedeeltes ontstaan puur door de dikte van het preparaat en daardoor kunnen niet alle details tegelijkertijd in focus zijn. Bij dit soort kleine kristallen wordt een eventuele chromatische abberatie snel zichtbaar.

Met de Zeiss Standard gebruik ik een soortgelijke camera-opzet. Hier gebruik ik een Zeiss Kpl10x oculair om het beeld mee op de sensor van de Canon 600D te projecteren.

Water uit een sloot waarin voornamelijk rust-stadia van Euglena te zien zijn. Foto gemaakt met een Carl Zeiss apochromaat 40/1.0 en schuine belichting. Het beeld is met een Zeiss Kpl10x oculair zonder camera-optiek op de sensor van de Canon 600D geprojecteerd.

Microscoop camera

In laboratoria wordt voornamelijk gewerkt met speciale c-mount microscoop camera's om alle beelden vast te leggen, vanwege de snelheid en het gemak van zo'n camera. Het zijn dure camera's maar ze leveren geen betere beelden op dan een oudere tweedehands systeemcamera. De kwaliteit van foto's gemaakt met een systeemcamera zal meestal hoger zijn.

Microscoop objectieven, oculairen en condensor

De invloed van het type objectieven en condensor op de fotografische kwaliteit wordt vaak overschat. De kwaliteit van het preparaat en de belichting is veel meer van invloed op het beeld. Bovendien hangt het van het type preparaat af welk objectief nuttig ingezet kan worden. Een grotere werkafstand is vaak belangrijker dan een hogere apertuur.

Objectieven met plan-correctie of niet?

Plan-objectieven vlakken de beeldveldkromming uit en zorgen er voor dat het beeld tot aan de rand scherp is. Deze objectieven worden bij voorkeur gebruikt bij zeer dunne en vlakke preparaten, bijvoorbeeld dunne weefselcoupes of gekleurde bloeduitstrijkjes. Het heeft weinig zin om een wat dikker preparaat dat niet vlak is te gaan bekijken met een plan-objectief. In zo'n preparaat heb je scherpe en onscherpe gedeeltes door verschillen in dikte waardoor sommige gedeeltes van het preparaat tot aan de rand scherp zullen zijn en andere gedeeltes weer niet. Ook voor onderzoek van bijvoorbeeld materiaal uit de sloot hebben zulke objectieven weinig meerwaarde. Daarbij komt dat plan-objectieven aanzienlijk duurder zijn dan objectieven zonder plan-correctie. Er zijn extra lenzen nodig zijn om alles tot aan de rand scherp te krijgen. Maar de beeldkwaliteit in het midden (daar waar je meestal naar kijkt en wat gefotografeerd word) kan met plan-objectieven nooit beter kan zijn dan met normale objectieven. Bij wat oudere objectieven die een niet zo goede anti-reflex coating bezitten kan de aanwezigheid van dit extra glas merkbaar zijn. Het beeld heeft dan wat minder contrast doordat door die extra lenzen meer reflecties en dus strooilicht ontstaat.

Zelf gebruik ik niet zo vaak objectieven met plan-correctie. Het idee dat er zoveel extra glas in deze objectieven zit, en dat alleen om wat rand-onscherpte te corrigeren, vind ik niet echt aantrekkelijk. Bovendien is mijn gedachte altijd: wat bekeken en gefotografeerd wordt ligt in het midden en niet aan de rand. Verder zie ik geen noodzaak om zoveel mogelijk van het beeldveld te fotograferen.

Achromaten, fluorieten of apochromaten?

Het idee dat je dure en hoog gecorrigeerde objectieven nodig hebt voor micro-fotografie is een fabel. In principe heb je niet meer nodig dan goede achromaten. Hiermee kunnen uitstekende foto's worden gemaakt. Zie ook 'Eerherstel voor de achromaat'. Wie met gewone achromaten geen bevredigende resultaten kan behalen doet iets fout. Er is altijd een compromis tussen scherpte-diepte en oplossend vermogen en het is zaak om er bij stil te staan welk objectief voor een bepaald type preparaat nuttig is. Een apochromaat met hoog oplossend vermogen stelt hoge eisen aan de kwaliteit van het preparaat. Hoe hoger het oplossend vermogen, hoe kleiner de werk-afstand van een objectief en het kan zomaar zijn dat het beeld van een apochromaat enorm tegenvalt doordat de kwaliteit van het preparaat te wensen over laat. En sommige apochromaten kunnen dermate veel lenzen bezitten dat het koste gaat van het contrast, met name bij oudere optiek.

Wil men beter gecorrigeerde objectieven dan zijn naar mijn mening de fluorieten (zoals bijvoorbeeld de Zeiss Neofluaren en Leitz Fluotaren ) een goede keus. Ze geven contrastrijkere beelden dan apochromaten en tonen minder chromatische aberratie dan achromaten.

Fluorieten en apochromaten zullen naar mijn mening nooit een volledige vervanging zijn voor achromaten, met name vanwege het verschil in scherpte-diepte.

De oculairen

Oculairen zijn er in vele soorten en maten. Voor de fotografie is het belangrijk dat er onderscheid wordt gemaakt tussen compenserende oculairen en oculairen die niet of nauwelijks compenseren. Bij alle planachromaten, (plan)fluoriet en (plan)apochromaten is het raadzaam een compenserend oculair te gebruiken. Dit geld ook voor de eenvoudige achromaten met een vergroting van 20x of meer. Bij de lager vergrotende achromaten, 10x en kleiner, is het echter het beste (uitzonderingen daargelaten) om een oculair te gebruiken dat niet of nauwelijks compenseert. Compenserende oculairen worden vaak aangeduid met een 'C', K, 'P' of met andere lettercombinaties die het woord 'photo' of 'compensation' aangeven. Maar het kan ook zijn dat deze aanduidingen er niet op staan. Op de WF10x oculairen voor de Olympus 37 mm objectieven staat bijvoorbeeld alleen 'WF'. Maar deze oculairen zijn wel degelijk compenserend. Bij twijfel is het verstandig om de optische specificaties van de fabrikant op te zoeken. En het is belangrijk om kritisch naar het beeld te kijken: hoe ziet het microscoopbeeld er aan de rand uit? Bij een mismatch tussen objectief en oculair treden chromatische aberratie en vervorming aan de rand van het gezichtsveld op. Meestal is het raadzaam om objectieven in combinatie met oculairen van dezelfde fabrikant te gebruiken. Maar ook hier zijn weer uitzonderingen op. De compensatie blijft echter het belangrijkst. Een 40/0.65 objectief zal vaker een beter beeld opleveren met een compenserend oculair van een andere fabrikant dan met een niet-compenserend oculair van dezelfde fabrikant. Zie ook: 'De juiste objectief-oculair combinatie'.

De condensor

Soms leest men dat voor kleurenfotografie een achromatische condensor aanbevolen wordt. Misschien dat hier in het pre-digitale tijdperk iets van waarheid in zat maar tegenwoordig is de invloed van sofware ter (kleur)verbetering van het beeld vele malen groter dan de achromatische correctie van een condensor. De meeste microscopen zijn standaard uitgerust met een twee-lenzige Abbe condensor die geen correctie bezit. Deze condensor is voor bijna alle doeleinden meer dan voldoende. De invloed van een achromatisch en eventueel aplanatisch gecorrigeerde condensor op het beeld wordt overschat, temeer ook omdat een condensor eigenlijk niet bijdraagt aan de totstandkoming van het beeld. Hoog gecorrigeerde condensoren zijn duur terwijl ze in de meeste gevallen weinig bijdragen aan de verbetering van het beeld. Dit soort condensoren zullen enkel nuttig zijn bij zeer kritische en hoge-resolutie microscopie waarbij het maximale aan oplossend vermogen moet worden behaald.

Beeldbewerking

Met beeldbewerkings software kunnen structuren en details in microscoop foto's nog beter naar voren worden gebracht. Met name contrast verbetering doet veel. Zelf gebruik ik hier het programma RawTherapee voor. Ik ben vrij voorzichtig met beeldbewerking, met name witbalans, contrast en belichting worden met mate aangepast. Ik ben van mening dat een foto er al vanaf het begin redelijk goed moet uitzien, zonder enige bewerking. Het is prima om in het beeld zichtbare hinderlijke vlekjes weg te werken die veroorzaakt zijn door stofdeeltjes die op een lens of de camera sensor hebben gezeten. Persoonlijk ben ik er geen voorstander van dat bepaalde details in een foto worden gewist, alleen om het onderwerp waar het om gaat er mooier uit te laten zien. Als er bijvoorbeeld algen uit de sloot gefotografeerd worden en die zijn omringd met bacteriën, dan horen die bacteriën er gewoon bij. Dit zijn de algen in hun natuurlijke leefomgeving die ze delen met andere organismen. Juist de onderlinge grootte-verhoudingen van verschillende organismen in hetzelfde beeld geeft veel meer betekenis aan dat beeld.